Preditox : genetic assays for safety use

Le test γH2AX-pH3

Updated : 10/10/2017

Afin de détecter le potentiel cancérigène de composés, le seul test de cancérogénèse existant est réalisé sur des rongeurs. Du fait des différences inter-espèces (métabolisme, réparation de l’ADN…), la validité des tests sur les animaux pour prédire des effets chez l’Homme peut être remise en question. Depuis 2007, la directive européenne REACH demande de développer des méthodes alternatives in vitro minimisant le recours à l’animal. Cette directive permet ainsi de caractériser rapidement et efficacement les potentiels génotoxique et cancérigène des milliers de composés chimiques mis sur le marché annuellement.

Le test de génotoxicité γH2AX/pH3 que nous avons développé est un test de génotoxicité in vitro, réalisé avec la technique de l'In-Cell Western (ICW) sur des cellules humaines (savoir-faire licence INRA). Ce test innovant permet d'étudier la génotoxicité d'un composé, ainsi que sa cytotoxicité, directement in cellulo. De plus, le test γH2AX/pH3 est le seul à pouvoir mettre en évidence les modes d'action génotoxique des composés testés de manière précise, en différenciant les molécules clastogènes et aneugènes (voir références, Khoury et al. 2016). De plus, le test γH2AX/pH3 permet de visualiser un effet protecteur (propriété antioxydante) d'un composé testé sur l'ADN.

Un test innovant et prédictif valide

Le test γH2AX (savoir-faire licence INRA): notre test est basé sur la phosphorylation de l’histone H2AX (γH2AX) qui peut être considérée comme un indicateur global de la génotoxicité. Le test γH2AX permet de détecter des composés avec différents modes d’action génotoxiques, tels que les adduits à l’ADN, stress oxydant, agents alkylants, agents aneugènes, inhibiteurs des topoisomérases, modifications du pool de dNTPs… L'utilisation de ce test dans la phase de découverte précoce du développement de médicaments peut s'avérer être un moyen précieux d'évaluer le potentiel génotoxique des xénobiotiques.

Différentiation des composés aneugènes et clastogènes

Il est dorénavant demandé de pouvoir différentier les composés avec des modes d’action aneugènes (modification du nombre de chromosomes) et clastogènes (induction de cassure de l'ADN).

Afin de répondre à cette demande, nous avons supplémenté notre test γH2AX par la quantification de la phosphorylation de l’histone H3 sur la sérine 10 (pH3) comme un biomarqueur des composés aneugènes. Nous avons démontré que l'utilisation combinée de ces deux biomarqueurs (γH2AX et pH3) permettait de différencier efficacement les molécules clastogènes des composés aneugènes, ainsi que les molécules cytotoxiques (voir référence, Khoury et al. 2016).

Principes : Les composés aneugènes induisent une augmentation ou une diminution de pH3 en fonction de leur mode d'action. Les molécules clastogènes induisent une augmentation de la phosphorylation d'H2AX, et les composés cytotoxiques induisent une diminution marquée de ces deux biomarqueurs. De plus, l'utilisation de différentes lignées cellulaires avec des capacités de biotransformations différentes permet de distinguer des composés génotoxiques bioactivés, sans avoir besoin d'un système d'activation métabolique exogène.

Egalement un test de cytotoxicité

Le test γH2AX/pH3 est réalisé avec la technique de l'In-Cell Western, ce qui permet d'étudier la cytotoxicité d'un composé en même temps que son effet génotoxique. Cette mesure de viabilité est plus sensible que le test MTT classique (voir référence, Graillot et al. 2012).

Exemples d'applications du test γH2AX/pH3

Fig. 1 : Image d'une plaque 96 puits obtenue par scanner après un traitement avec différents composés. L'ADN est représenté en rouge, le biomarqueur d'intérêt est en vert.

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Compounds Metabolic activation required Mode of actiona Ames assayb MN assayc γH2AX/pH3 assayd
Benzo[a]pyrene + C + + +
Etoposide - C E + +
Chlorothalonil + C - +
Taxol - A - + +
Nocodazole - A - + +
Hydroquinone - C/A - + +

Fig. 2 : Résultats obtenus à partir de différents tests de génotoxicité. a Modes d'action: C = Clastogène ; A = Aneugène; C/A = les deux, b Test d'Ames: test in vitro réalisé sur des bactéries, c Test du micronoyau: test in vitro réalisé sur des cellules HepG2, d Test γH2AX/pH3: réalisé avec la technique ICW sur des cellules HepG2.